什么人容易得骨髓瘤(小鼠骨髓瘤细胞)

一、骨髓瘤和白血病有什么区别

白血病是一种造血干细胞异常的血液疾病，它会在骨髓和其它造血器官中出现恶性增殖的现象。白血病在任何人体上都可能出现，白血病这种癌症与其它的癌症有所不同的是，它会扩散到全身，而多发性骨髓瘤是一种恶性的细胞疾病。下面具体讲讲什么是多发性骨髓瘤，以便让大家区别它与白血病之前的关系。多发性骨髓瘤(MM)为发生于B淋巴细胞的恶性浆细胞病。好发于中老年，但近年发病率有增高及发病年龄有提前趋势。本病误诊率很高，患者可因发热、尿改变、腰腿痛被误诊为呼吸系统感染、肾炎、骨病而延误病情。在诊治中应予足够重视。多发性骨髓瘤临床上的误诊率高达40-50%，引起误诊的常见临床表现如下：一、感染;由于正常免疫球蛋白减少，异常免疫球蛋白增多但无免疫活性;白细胞减少、贫血及放化疗等影响正常免疫功能，故易于反复感染。患者可以发热作为首发症状就诊。易发生上感、肺炎等呼吸道感染或泌尿系统感染，女性患者更易于发生泌尿系统感染。在病程晚期，感染是致死的主要原因之一。故对于中老年患者反复发生感染，不应仅局限于抗感染治疗，应在抗感染治疗的同时，积极寻找是否有原发病。二、骨髓瘤骨病;骨痛和溶骨性骨质破坏是本病的突出临床表现。骨痛部位以腰背部最多见，其次为胸骨、肋骨和下肢骨骼。由于本病患者常有严重骨质疏松，常在稍用力或不经意情况下即可发生病理性骨折，可造成的机械性压迫引起神经系统症状，严重者造成截瘫。若截瘫时间过久即使经过有效治疗，患者也很难恢复行走，极大地影响患者的生存质量。也可出现骨骼肿物，瘤细胞由骨髓向外浸润骨质、骨膜及临近组织形成肿块。局限于一个部位的孤立性浆细胞瘤较少见，最终可演变为多发性骨髓瘤。针对的介绍，白血病容易被误诊为多发性骨髓瘤，所以，对于白血病患者应该了解下什么是多发性骨髓瘤，这有利于白血病的诊断。

二、骨髓瘤 能治吗

多发性骨髓瘤

多发性骨髓瘤是侵犯骨髓的一种浆细胞恶性肿瘤。血液中有些白血球离开骨髓后产生浆细胞，不同型态的浆细胞，产生不同的抗体去对付不同外物的侵犯，但是当浆细胞由於某种原因而过度生长，不但数量增加，而且型态相同即成为骨髓瘤细胞。

这些细胞有时集结在一个局部骨质上形成浆细胞瘤，有时都会侵犯多处骨头，形成多个癌块，即称为「多发性骨髓瘤」。骨髓瘤破坏骨骼发生疼痛或骨折；或使钙质留入血流中，产生食欲不振，疲倦，肌肉无力，甚至神志不清，或因免疫力降低，发生严重感染；或引起贫血，肾功能失退等。多发性骨髓瘤的发生率约为3/100,000，大部份（60％）发生在男性，98％在40岁后发生。

病因

确实致病原因未明，可能与遗传有关；当侵犯第8，11或14对染色体，产生基因变异，或暴露於有毒化学物或强烈辐射线，亦是部份因素。

潜伏性基因变异到发病可能有20年之久，局部侵犯较少（约7％）大部份是广泛性及进行性。可分为：

1.骨骼侵犯：多发生在头骨，脊椎骨，肋骨，盆骨及近侧长骨。

2.血钙增高：1/3的病人有血钙增高，而有呕吐，食欲不振等情形。

3.蛋白质异常：会产生M型蛋白质，亦会降低免疫球蛋白的产生，导致身体防御减低。

4.肾功能减退：约有一半的病人会得肾脏病变。

5.神经功能受损：约有15％病人有脊椎神经受压情形，中央神经周围神经亦可被浆细胞侵润使功能受损害。

诊断

1.症状：疲乏，无力，体重减轻，骨头疼痛，怕冷，神经失调，出血趋势等。

2.病徵：偶有肝脾肿大，淋巴肿大，而多半有神经病状。

3.检验：

A贫血，血小板减少，中性白血球减少。

B骨髓或骨的病灶、肿块或淋巴结的病理检查。

C血清蛋白质测定，会有M Protein增高，IgG增高

D骨骼摄影，骨质密度测定，磁共振

治疗

·骨科辅助手术

·放射线电疗

化学物治疗

参考资料：http://www.vghks.gov.tw/hema/myeloma.htm

多发性骨髓瘤

一、概述

浆细胞病是指单克隆浆细胞异常增生，伴有单克隆免疫球蛋白或多肽链亚单位合成增多

的一组疾病，其中包括浆细胞瘤（软组织或骨）、巨球蛋白血症及多发性骨髓瘤。

正常情况下，浆细胞具有分泌免疫球蛋白的功能。一株浆细胞或其前体细胞受某一些抗

原的刺激后，增殖为一组单克隆浆细胞，并分泌一定量针对该抗原的单克隆免疫球蛋白

。人体内有成千上万株浆细胞合成和分泌成千上万种化学结构和免疫特性均不同的多克

隆免疫球蛋白。每一个免疫球蛋白分子由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。根据

重轻链氨基酸组成与抗原性不同，将免疫球蛋白分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和

IgE。轻链分为κ轻链和λ轻链。每株浆细胞只能合成一种重链和一种轻链。同属一类的

免疫球蛋白，由于来自不同浆细胞的合成和分泌，因此，在重链、轻链的免疫特异性上

存在着差异而呈多克隆性。故人体血清中的免疫球蛋白是五类免疫球蛋白的混合体，而

每类免疫球蛋白又是多种既相同又有着差别的多克隆免疫球蛋白组成。

浆细胞病表现为单克隆浆细胞系异常增生合并合成和分泌化学结构与免疫特异性完全相

同的单克隆免疫球蛋白或其多肽亚链，临床上称为“M”成分（monoclonal component)

或“M”蛋白。当单克隆浆细胞异常增生时，正常的多克隆细胞增殖受到抑制，正常多克

隆免疫球蛋白的合成与分泌减少。由于大量泳动速度相同的单克隆免疫球蛋白，“M”蛋

白在电泳时表现为底部窄而峰甚高的图像。经化学分析、免疫电泳分析可以确定“M”蛋

白为单克隆免疫球蛋白或多肽链亚单位。

浆细胞病在本质上与B细胞淋巴瘤是相同的，只是不同阶段的表现。多发性骨髓瘤（mu-

ltiple myeloma,MM)是最常见的恶性浆细胞病，以单克隆IgG、IgA和（或）轻链大量分

泌为特征。其它恶性浆细胞病包括原发性巨球蛋白血症（IgM异常分泌增多），重链病和

原发性淀粉样变性。恶性浆细胞产生的各类M蛋白出现频率如下：

含重链和轻链的M蛋白。。。。百分比含重链和轻链的M蛋白。。。。。。...百分比

IgG........................52

IgA........................21

IgM........................12

IgD........................2

IgE........................0.01含轻链的M蛋白（κ或λ）。。。。。。。11

含重链的M蛋白（γ、α、μ、δ、ε）。1

>2类M蛋白。。。。。。。。。。。。。..0.5

血或尿中无M蛋白.....................1

三、小鼠骨髓瘤细胞***是什么

骨髓瘤细胞是一种癌细胞，他对小鼠造成伤害就是通过不断增殖造成的。所以最后小鼠会腹水，这时候可以从腹水中提取单克隆抗体。小鼠最终会因为骨髓瘤细胞过度繁殖死亡。就和患癌症一样，但是小鼠在实验室中有很多，所以实验室还用这个办法制备单克隆抗体。

四、骨髓瘤 培养

杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。

在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。

淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。

1、动物免疫

(1)抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。

(2)免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。

(3)免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞

融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

表6-1不同免疫抗原的免疫程序

免疫原特性抗原量接种次数间隔时间单抗的特性抗体滴度亲和性

免疫原性强（如细胞、细菌和病毒等） 106-107个细胞或1-10ug 2-4 2-4周高中等至强

免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周中等或高中等或强

免疫原性弱 A.20-400ug 2-4随后 2-3每月 2-3月中等强

B.10-50ug其后 200-400ug 2其后 4每月每天中等中等

C.10-100ug 2其后 4其后“休息”最后加强每月 10天 1-2月

中等中等或强

体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此，针对这些情况，可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤2-3次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，细胞抗原105-106个细胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液；在37℃，6%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。

2、细胞融合

（1）主要试剂的配制

a、细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。

"不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml

100×L.G.溶液1ml

双抗溶液1ml

7.5% NaHCO3溶液1-2ml

HEPES溶液1ml

"不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g

超纯水或四蒸水980ml

NaHCO3 3.7g

双抗溶液10ml

100×L.G.溶液10ml

用1N HCl调试PH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。

"完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml

小牛血清15-20ml

用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。

"HT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml

HT贮存液1ml

"HAT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml

HT贮存液1ml

A贮存液1ml

b、氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L）:称取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。

c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L):称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。

d、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）:称取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。

e、青、链霉素（双抗）溶液（100×）:取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。

f、 7.5% NaHCO3溶液:称取分析纯NaHCO3 7.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。

g、 HEPES溶液（1mol/L）:称取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。

h、 8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）:称取200mg 8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。

g.用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。

h.镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

i、 50% PEG:称取PEG 1000或4000 20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5% NaHCO3调PH至8.0，或购买Sigma或Gibco公司现成产品。

⑵髓瘤细胞的准备

融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤是最为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中，方法是用6个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14-16小时。

骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：

a、于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。

b、融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。

c、 1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。

d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。

e、取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞数×105/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×106/2

⑶脾淋巴细胞的准备

取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏（也可用注射器内芯挤压脾脏），使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。

⑷饲养细胞（Feeder cells）的制备

在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。

常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为普遍。其制备方法如下：

按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。通常对巨噬细胞来说，96孔培养板每孔需2×104个细胞，24孔板每孔需105细胞。每只小鼠可得3-5×106个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞，这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。做法是，将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml（相当于2滴），然后置37℃ 6% CO2的培养箱中培养。

⑸细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

细胞融合的程序已报道的有很多种，这里介绍的是作者所在实验室常用的一种。

A、将1×108脾细胞与2×107-5×107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。

B、 1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。

C、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40℃水浴中预热。

D、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，边加边轻轻搅拌。

E、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基；20-37℃静置10分钟。

F、 1000r/min 5分钟；弃去上清。

G、加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。

H、分装96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将培养板置37℃，6% CO2培养箱内培养。

I、 5天后用HAT培养基换出1/2培养基。

J、 7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。

L、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。

3、杂交瘤细胞筛选

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便，便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果，以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来，在融合之前就必须建立好抗体检测方法，并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”，即检出背景以上的最强与最弱信号之比，依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的，100%的抗原参与反应，一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面，如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原，检测系统可能需要能测出微弱信号，则动力学范围至少应为10：1，最好为100：1。另外，检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体，就要用结合蛋白A的检测方法。

下面简要介绍几种常用的抗体检测方法：

⑴免疫酶技术

免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。

A、器材和试剂

a.包被缓冲液：

碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。

Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。

b.洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4"12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。

c.稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。

d.酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。

e.底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。

f.底物使用液：

OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2 0.15ml。

TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。

ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。

g.抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。

h.抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。

病毒感染的传代细胞或全菌抗原。

淋巴细胞等悬液。

i.酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。

j.细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。

k.聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。

l.酶联免疫阅读仪；或光镜。

m.吸管、加样器及水浴箱、离心机等。

B、可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）

a.纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。

b.以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

c.弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。

d.每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。

e.洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。

f.每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。

g.加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。

h.加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分钟。

i.以2mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。

j.结果判定：以P/N≥2.1，或P≥N 3D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

C、全菌抗原的ELISAS

a.新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮，并调整细菌浓度至1×108个/ml。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作，最好是灭活处理。

b.每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次；加上述细菌悬液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。

c.步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟，蒸馏水洗涤3次；每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。

d.洗涤液洗3次；此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。

e.以下步骤同上法。

D、用全细胞抗原的ELISA

a.按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液。

b.淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1500rpm离心30分钟，吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0.83%的氯化铵溶液，室温10分钟，洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。

c.每孔加100ul上述a或b的细胞悬液，使每孔含细胞5×104个；1500r/min 15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分钟；可4℃或-20℃保存备用。

d.以下步骤同上法。

E、抗体捕捉ELISA试验

本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法是常用的ELISA中较理想的一种；其操作步骤如下：

a.以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板，每孔加100ul，37℃ 2小时或4℃过夜。

b.洗涤、拍干后加待测的McAb样品，37℃ 1-2小时。

c.洗涤后加适量的抗原，37℃ 1-2小时。

d.洗涤后加入酶标多克隆抗体，37℃ 1-2小时。洗涤后加底物显色，判定结果。