细菌计数板使用方法(微生物菌落总数的测定)

一、菌落总数的检测

平皿计数法

菌落总数(standardplate-countbacteria):水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。

仪器和装置

高压蒸汽灭菌器。

干热灭菌箱。

培养箱(36±1)℃。

电炉。

冰箱。

放大镜或菌落计数器。

pH计或精密pH试剂。

灭菌试管。

平皿直径9cm。

培养基与试剂

营养琼脂成分蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂10～20g、蒸馏水1000mL。

制法将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中(如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经103.43kPa(121℃)灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

检验步骤

1)水样处理。

a.饮用水。以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入来菌平皿中，倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。

待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于(36±1)℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为1mL水样中的菌落总数。

b.水源水。以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1∶10稀释液。

吸取1mL1∶10的稀释液注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1∶100稀释液。按同法依次稀释成1∶1000、1∶10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。

用灭菌吸管取未稀释的水样和2～3个适宜稀释度的水样各1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。

2)菌落计数及报告方法。作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。

不同稀释度的选择及报告方法:

首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例1)。

若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数(如表82.2中实例2)。若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数(如表82.2中实例3)。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数(见表82.2中实例4)。

若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例5)。

若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例6)。

若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例7)。

若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。

如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿度面积63.6cm2，再乘其稀释倍数作报告。

菌落计数的报告:菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字;在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示(见表82.2“报告方式”栏)。

表82.2稀释度选择及菌落总数(CFU)报告方式

二、菌落计数方法

1、计数器测定法。

即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。

2、电子计数器计数法。

电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

3、活细胞计数法。

常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。

4、比浊法。

比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。

5、测定细胞重量法。

此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；

6、测定细胞总氮量或总碳量。

氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。

7、颜色改变单位法。

这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物。

三、菌落总数培养皿怎么数,片上面又有好多小点要数吗

固体培养基表面及内部的可见菌落（包括小点）均要计数，计数时可用笔在培养皿背面划线，分若干块计数

细菌菌落总数（CFU）的测定

一）平板菌落数的选择

1、进行平皿菌落计数时，记下同一浓度的3个平板（或2个）的菌落总数，计算平均值，再乘以稀释倍数即为1ml水样中的细菌总数。

2、计数时应选择菌落数在30~300/皿之间的稀释倍数进行计数，若同—个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。若片状菌落少于平皿的一半时，而另—半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后，应算出同一稀释度的平均菌数，供下—步计算时用。

(二)

稀释度的选择

l、首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可用它作为平均值乘其稀释倍数。

2、若有两个稀释度的平均菌落数都在30～300之间，则应按两者的比值来决定。若其比值小于2，应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落数。

3、如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

4、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

5、如果全部稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

6、菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字；在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数,也可用10的指数来表示，在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水样的稀释倍数。

四、菌落计数器如何使用

菌落总数检测一般步骤为：

采样—样品制备与稀释—倒平板—涂布平板—倒置培养—菌落计数—计算菌落总数

样品制备，需要对样品进行均质，根据客户需要检测的样品不同。WIGGENS提供不同的均质设备，如均质机，拍打式均质器等；

样品的稀释，国标中采用1:10的十倍稀释方法，SOCOREX提供各种手动精密移液器，瓶口分液器，移液管控制器为液体操作提供了保证。

倒平板，使用的培养基为含有琼脂的固体培养基。培养基在配备的过程中需要经过煮沸和保温的步骤。WIGGENS红外加热磁力搅拌器，直接使用红外辐射方式进行加热，1L培养基只需要10分钟即可煮沸，极大节约了客户培养基制备时间。在倒平板之前，需要恒温培养基46±1℃， WIGGENS恒温水浴锅，可以为用户提供的温度控制和恒温条件；

涂布平板，培养基在培养皿中冷却成固态之后，将稀释后的样品用移液器取1mL,滴到培养基表面，用涂布棒涂匀。WIGGENS有专用的培养皿转盘，可以有效的将样品液均匀的涂布在培养基表面。

倒置培养，将涂布完毕的平板，放入恒温培养箱中进行培养，一般培养时间约为48h。WIGGENS恒温培养箱内容积50-140L各种规格的台式及落地式培养箱，先进的设计及数据接口，可以直接通过电脑编程控制及信息处理，非常适合规范化培养要求。

菌落数计算，经过48小时的培养之后，在培养基表面会长出菌斑，每个菌斑代表一个微生物。一般在培养皿中菌落数为30-300个之间，为有效菌落数。低于30个，会因为样本量不足，随机性大；超过300个，会因为菌落数太多，过于密集产生菌斑重叠等现象，不利于准确计数。WIGGENS菌落计数器，是带有非闪烁式环形光源，放大镜，压力传感器，计数笔等，可以让使用者轻松计数。

计算菌落总数，培养皿中的菌落数需要通过公式换算。 WIGGENS菌落计数器，配套软件可以直接通过压力传感器进行培养皿中菌落计数，通过软件内嵌程序直接计算出被检测样品中菌落总数。